　　導(dǎo)致假陰性率發(fā)生的原因很多。2月22日,，南京大學(xué)模式動物研究所發(fā)育生物學(xué)與遺傳學(xué)教授趙慶順接受科技日報記者獨家采訪時指出,，依據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)發(fā)布的指南，核酸檢測前需將采集到的樣品進(jìn)行56℃滅活,，這極有可能使新冠病毒核酸被降解,，從而導(dǎo)致不能被正常檢出，最終提高了假陰性率,。該研究成果《病毒核酸提取前的高溫滅活過程顯著降低可檢出病毒核酸模板量》,，已在中國科學(xué)院科技論文平臺預(yù)發(fā)布。

　　56℃滅活可能導(dǎo)致病毒核酸被降解

　　2019新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈RNA,。因此,，科研人員的目標(biāo)是在患者身上找到新冠病毒的RNA。這也是臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn),。

　　目前,，臨床檢測主要采用熒光定量RT-PCR試劑盒檢測。該方法是將標(biāo)本中的特定RNA序列逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增,，經(jīng)過30次以上擴(kuò)增后,，病毒基因片段達(dá)到一定數(shù)量即可進(jìn)行可視檢測。

　　“理論上,，哪怕模板只有1個病毒,，就有可能被檢測出來,。”趙慶順說,，科研實踐中,，在模板(病毒)量大于100個的情況下，擴(kuò)增結(jié)果就會非常穩(wěn)定,。

　　但是,，趙慶順在網(wǎng)絡(luò)上看到一個教學(xué)視頻，不禁心生疑慮,。該視頻由北京協(xié)和醫(yī)院和北京市衛(wèi)健委聯(lián)合制作,。視頻3分08秒至3分40秒顯示：在制備核酸模板前，需將采集到的樣品在56℃條件下進(jìn)行30分鐘病毒滅活,。

　　記者在中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護(hù)指南(試行第一版)》中也看到：核酸擴(kuò)增前,，可以對標(biāo)本先行消毒。包括56℃孵育30分鐘,，加蛋白酶K,。

　　中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》中，明確指出需將樣品56℃孵育至少45分鐘或更高溫度進(jìn)行滅活,。

　　記者通過采訪確認(rèn),，絕大多數(shù)檢驗醫(yī)師均按照上述規(guī)范，進(jìn)行56℃條件下時間不等的病毒滅活,，然后才制備核酸模板,。

　　這樣做帶來的問題是，病毒RNA極易被核糖核酸酶降解,，因為這種酶在60℃時活性最高,。核糖核酸酶來自兩方面，一是樣本細(xì)胞內(nèi),，二是采集,、保存、運(yùn)輸過程中的外來污染物,。

　　進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮

　　“進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮,，保護(hù)從事檢測的工作人員不被病毒感染?！壁w慶順說,。

　　正是出于這方面的考慮，國家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)文件中,，明確要求對標(biāo)本進(jìn)行滅活處理,。

　　北京協(xié)和醫(yī)院制作的教學(xué)視頻以及中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《防護(hù)指南》和《專家共識》，依據(jù)正是來自國家衛(wèi)健委相關(guān)文件，包括《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南(第三版)》等,。

　　但是,，記者查詢了國家衛(wèi)健委相關(guān)文件，其對于病毒滅活的具體方法并未做出明確規(guī)定,，只是籠統(tǒng)地要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測,。

　　趙慶順進(jìn)一步查閱了美國疾控中心、香港大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院以及華大基因發(fā)布的核酸檢測說明,，也未發(fā)現(xiàn)56℃滅活這一步驟,。

　　病毒核酸降解對檢測結(jié)果影響究竟有多大

　　記者在采訪中發(fā)現(xiàn)，不同人士對這個問題的回答涇渭分明：

　　來自疾控部門,、中國醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會,、相關(guān)醫(yī)院檢驗醫(yī)師的看法是，不會對檢測結(jié)果有太大的影響,。而趙慶順等專家認(rèn)為,，核酸提取前對人體樣品進(jìn)行高溫殺毒處理，可能是導(dǎo)致新冠病毒核酸檢出假陰性率過高的重要原因之一,。

　　趙慶順以豬流行性腹瀉病毒(一種冠狀病毒,，來自活疫苗)為模型開展了高溫滅活對病毒可檢出量影響的研究,，結(jié)果表明：保存在普通等滲溶液(Hank’s液)中的樣品經(jīng)56℃孵育30分鐘,，導(dǎo)致樣品中可檢出的冠狀病毒模板減少一半，如果以92℃孵育5分鐘,，則可檢出的冠狀病毒模板損失96%以上,。

　　“理論上，不排除新冠病毒的目標(biāo)RNA片段在56℃以上高溫滅活中不易被降解的可能,?！壁w慶順坦言，“但我寧愿自己的判斷是錯的,，也不希望因為某個細(xì)節(jié)考慮不周而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性,。”

　　另外,，不同品牌的樣品保存液,，也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響。趙慶順在實驗中發(fā)現(xiàn),，在56℃30分鐘條件下,，采用南京諾唯贊研發(fā)的R503保存液存放豬流行性腹瀉病毒樣品時，病毒核酸的可檢出量是對照組(Hank’s液)檢出量的3倍,；而如果是92℃5分鐘滅活,，則檢出量是對照組的42倍。

　　中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會主任委員王成彬教授在撰文回應(yīng)核酸檢測假陰性率較高現(xiàn)象時也指出，不同提取試劑對最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別,，從而直接影響檢測結(jié)果,。他建議，對于某些高度疑似病例,，或檢測結(jié)果難以確定的病例,，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測、驗證,。

　　“假陰性意味著漏檢,，不僅會導(dǎo)致臨床中對疑似患者不能快速確診，而且會使漏檢者成為潛在的病毒傳染源,?！壁w慶順為此提出建議，一是盡量使用無核糖核酸酶污染的樣本采集管,，二是將標(biāo)本放置在可保護(hù)病毒核酸免受高溫滅活損壞的樣品保存液中,，從而確保樣品RNA從保存、運(yùn)輸?shù)礁邷販缁畹鹊玫饺瘫Ｗo(hù),，盡最大可能保證用于臨床檢測的核酸質(zhì)量,，減少病毒核酸可檢出模板在核酸提取前的人為損壞。

（責(zé)編：鄢妮）